全世界约有30-40%的可耕地和50%的潜在可耕地属于酸性土壤[1]，铝离子毒害是该类土壤中限制作物生产的主要因素[2]。在长期适应过程中，植物进化出了多种耐铝机制。其中，植物通过根尖细胞向外分泌苹果酸等有机酸螯合根际土壤溶液中的铝离子，从而消除其毒性，是植物抵御铝毒的主要途径[2,3]。早在2004年研究者就发现植物根细胞中铝激活的苹果酸分泌是由苹果酸转运蛋白（Aluminum-activated Malate Transporter，ALMT1）介导[4]。之后，研究者证实了在小麦、拟南芥、油菜、大豆、黑麦等多种植物中该机制具有保守性。但是，长期以来人们对于铝离子如何激活ALMT1转运苹果酸仍不得而知。
2021年11月19日，浙江大学郭江涛、杨巍和郑绍建三个课题组组成的合作团队在Cell Research上在线发表了题为Structural Basis of ALMT1-Mediated Aluminum Resistance in Arabidopsis的研究论文，解析了拟南芥ALMT1通道蛋白（AtALMT1）多种状态下的三维结构，结合电生理实验、分子动力学模拟和拟南芥体内实验，阐明了AtALMT1介导的铝激活苹果酸转运的分子机理。
该研究表明，AtALMT1结构是一个新型的阴离子通道结构。AtALMT1以二聚体形式组装成一个阴离子通道，每个亚基包含6个跨膜螺旋（TM1-6）和6个细胞质侧的螺旋（H1-H6）。来自两个亚基的十二个跨膜螺旋组装成离子通透孔道（图1）。
图1 AtALMT1的结构。A，AtALMT1的冷冻电镜三维重构（左）和卡通模型（右）的侧视图（上）和俯视图（下）。B，AtALMT1单个亚基的侧视图。C，AtALMT1的拓扑结构。
在苹果酸结合的AtALMT1结构中，研究人员观察到苹果酸位于AtALMT1的离子通透孔道中间，与两对精氨酸残基（Arg80和Arg165）相互作用（图2A，2B）。研究人员通过分子动力学模拟和电生理实验验证了这一苹果酸结合位点。在电生理实验中，这两个关键精氨酸的突变都能显著影响AtALMT1对苹果酸的通透，其中Arg165突变使AtALMT1完全丧失苹果酸传导的功能（图2C）。
在铝离子结合的AtALMT1结构当中，研究人员发现铝离子主要结合在AtALMT1的细胞外侧，由TM1-2 loop和TM6上的三个带负电的氨基酸残基配位（Asp40、Glu156和Asp160）（图2D，2E）。电生理实验表明，这三个位点氨基酸的突变会显著降低AtALMT1介导的铝激活的苹果酸的通透（图2）。
图2 AtALMT1中苹果酸和细胞外侧铝离子的结合位点。A，离子通透孔道中的一对保守的精氨酸Arg80和Arg165。B，苹果酸与两对精氨酸相互作用。C，精氨酸Arg80和Arg165突变显著降低AtALMT1对苹果酸的通透。D，AtALMT1中细胞外侧铝离子的结合位点。E，铝离子与周围的酸性氨基酸Asp40、Glu156和Asp160相互作用。F，Asp40、Glu156和Asp160突变显著降低AtALMT1介导的铝激活的苹果酸的通透。
为验证AtALMT1中苹果酸和铝离子结合位点的氨基酸的作用，研究人员培育了这些氨基酸突变的拟南芥转基因株系。发现在没有铝离子的情况下，突变系表现出与野生型相似的根生长和苹果酸分泌；在铝离子处理后，突变系表现出显著降低的根生长和苹果酸分泌，表现出与功能缺失突变体almt1相似的表型（图3）。因此，这些体内实验进一步确认了苹果酸和铝离子结合位点的氨基酸在铝激活苹果酸转运中的重要作用。
图3 拟南芥体内验证AtALMT1中苹果酸和铝离子结合位点的氨基酸的作用。A-B，野生型、AtALMT1缺失突变株almt1、苹果酸结合位点精氨酸突变株R80A和R165A的根系生长（A）和苹果酸分泌（B）。C-D，野生型、AtALMT1缺失突变株almt1、铝离子结合位点突变株E165A和D160A的根系生长（C）和苹果酸分泌（D）。
未结合铝离子的AtALMT1处于关闭状态，结合铝离子的AtALMT1通道处于开放状态。通过比较关闭状态和开放状态的AtALMT1的结构，研究人员提出了铝离子激活AtALMT1的分子机制。在酸性条件下，铝离子结合在AtALMT1的胞外侧TM1-2 loop和TM6之间，与三个酸性残基（Asp40、Glu156和Asp160）配位，引起TM1-2 loop和TM5-6 loop构象变化，从而导致Ile53残基向外运动，引起孔道开放（图4）。
图4 细胞外侧铝离子激活AtALMT1。A，未结合铝离子（蓝色）和结合铝离子（绿色）的AtALMT1的结构比较俯视图。B，未结合铝离子的AtALMT1的离子通透路径。C，结合铝离子的AtALMT1的离子通透路径。
上述研究解析了AtALMT1多种状态下的三维结构，完美诠释了AtALMT1介导的铝激活苹果酸转运的分子机理（图5），为基于蛋白结构设计ALMT1功能获得性突变体以增强作物根系铝激活的苹果酸分泌，进而培育耐铝作物提高酸性土壤的生产力提供理论指导。
图5 铝激活AtALMT1转运苹果酸的分子机理。
郭江涛课题组博士生王江勤、杨巍课题组余夏飞博士、郑绍建课题组丁忠杰研究员和中科院深圳先进技术研究院的张小康研究员为论文的共同第一作者。郭江涛、杨巍和郑绍建为共同通讯作者。本研究还得到了中国海洋大学徐锡明副研究员的支持。本研究受科技部重点研发计划、自然科学基金委、浙江省杰青等项目的资助。
原文链接：https://www.nature.com/articles/s41422-021-00587-6
参考文献：
[1] Uexküll, H. & Mutert, E. Global extent, development and economic impact of acid soils. Plant Soil. 171, 1-15 (1995).
[2] Kochian, L. V. P., M. A. Liu, J. Magalhaes, J. V. Plant Adaptation to Acid Soils: The Molecular Basis for Crop Aluminum Resistance. Annu. Rev. Plant Biol. 66, 571-598 (2015).
[3] Sasaki, T., Yamamoto, Y. et al. A wheat gene encoding an aluminum-activated malate transporter. Plant J. 37, 645-653 (2004).
[4] Tashiro, M., Furihata, K., Fujimoto, T., Machinami, T. and Yoshimura, E. Characterization of the malate-aluminum (III) complex using 1H and 27Al NMR spectroscopy. Magn. Reson. Chem. 45, 518-521 (2007).