浙江大学系统神经与认知科学研究所奚望副教授团队主要关注于神经血管耦合机制以及成像新技术研发。在前期系列神经-血管深度成像技术基础上（Biomaterials，2022a；Biomaterials，2022b；ACS nano，2022；eLight 2022；Small Methods 2022a），开发了一种适用于活体动物脑部皮层血管，可实时观测血栓形成的、具有高度空间选择性的精准光血栓方法（precision ultrafast laser-induced photothrombosis，PLP），结合双光子成像方式，实现了脑皮层内任意深度（0-815μm）及各种尺寸血管的精确可控的血栓，为脑血管疾病提供了一种实用和准确的血栓模型。文章的第一作者为浙江大学系统神经与认知科学研究所博士生朱亮。系统所多光子成像平台为本文提供了技术支持。浙江大学系统所副教授奚望、Anna Wang Roe（王菁）教授为本文的共同通讯作者。
大脑的正常功能与稳态维持依赖于脑血管内血流的持续和准确输送，而血流的非正常扰动会影响大脑功能的维持，并可能危及神经元或神经胶质细胞的存活。了解这些潜在的生理或病理的脑血流灌注系统及其机制，特别是微小血管病变的急性生长和演化过程，对于解析健康和疾病中的大脑功能及神经血管耦合机制至关重要，也是开发中风和阿尔茨海默症等疾病后出现的血流控制缺陷的治疗方式的先决条件。目前已有诸多研究通过建立一系列的动物模型以模拟脑血管功能障碍疾病来探索缺血性血栓下的病理学演变和恢复机制。常规方法例如大脑中动脉栓塞技术，玫瑰红诱导的单光子光血栓等可以构建各类血栓模型以模拟血管障碍性疾病，但在深度、准确性和可靠性等方面仍然存在技术挑战，特别是对于体积小且“难以捉摸”的毛细血管网，目前尚没有可靠有效的深层毛细血管血栓形成的有效策略。
玫瑰红（RB）诱导的光血栓是大脑皮层血栓构建的常规技术手段，通常使用波长为530至580 nm的绿光激发玫瑰红产生活性氧（ROS）以形成血栓。然而受限于单光子激发的特性，在光血栓过程中可能会造成离焦激光的非目标激发，其空间分辨率和穿透深度有限。因此，利用长波长的飞秒激光激活玫瑰红产生非线性吸收来诱导血栓形成是一种可行的优化策略。为了系统性的评估飞秒激光诱导的的光血栓形成效应，本研究首次量化和评估了双光子成像常用的720-1070 nm波段的飞秒激光激发下光血栓形成的稳定性和效率（图1）。通过典型的光栅式扫描，所有波长的飞秒激光都可以有效的诱导玫瑰红光激活，在浅层皮层的血栓形成成功率达80%以上，并在深部皮层也能有效的诱导血栓形成。展示了玫瑰红的双光子激发诱导的可行性和有效性，对于表征基于双光子吸收的玫瑰红的光敏性很有价值，对于飞秒光诱导的体内光血栓的形成也具有指导意义。
为了进一步构建高效可靠的光血栓形成手段，选定具有良好的组织穿透能力的1070 nm飞秒激光配合螺旋式扫描作为玫瑰红激发的扫描方式，并采用光扫描+成像的特定方式，可以在保证高效激发的同时实时观测血栓形成（图1）。螺旋式扫描在血管腔内ROI内以固定个高速持续扫描，保证了扫描区域内ROS的高效和集中产出，减少了弥漫性单线态氧产生，使得光血栓的确切位置变得更精确可控，同时也减少了光热损伤。
图1 a-c，PLP方法诱导光血栓形成的原理和模式图。d-f，光血栓形成的实例以及对照实验。
凭借出色的组织穿透性和高效的光血栓形成能力，本研究提出的PLP方法可在各种类型，尺寸和深度的血管实现精准且可重复的血栓。对于不同类型（动脉，静脉，毛细血管）和深度（pial到815 μm）的血管，PLP方法制定了一系列对应的参数以实现准确高效的光血栓形成。此外，PLP方法可以在脑皮层的各种血管中实现精准可控的血栓，且不会对邻近组织和上覆血管造成额外损伤或离焦激发，是高度精准和可靠的，在清醒动物中同样适用（图2）。总的来说，PLP方法提供一种便捷和实用且具有深度选择的血管血栓形成技术，为研究微血管缺血与局部生理病理变化之间的关联性提供了更多的选择。
图2 PLP方法在脑皮层的各种血管中实现精准可控的血栓实例。
相关工作受到科技部2030重大计划，国家自然科学基金，浙江省领雁计划，浙江省自然科学基金，中央高校基本科研基金等基金资助，以及浙江大学脑与脑机融合前沿科学中心、浙江大学生物医学工程教育部重点实验室等大力支持。
论文信息：
Precision 1070 nm Ultrafast Laser-Induced Photothrombosis of Depth-Targeted Vessels In Vivo
Liang Zhu, Mengqi Wang, Peng Fu, Yin Liu, Hequn Zhang, Anna Wang Roe*, Wang Xi*
Small Methods
DOI: https://doi.org/10.1002/smtd.202200917.
原文链接：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/smtd.202200917